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Scientific Reports volume 12, Artigo número: 21413 (2022) Citar este artigo 941 Acessos 4 Citações Métricas detalhes Neste trabalho, demonstramos o desenvolvimento de uma solução rápida e sem rótulos

Scientific Reports volume 12, Artigo número: 21413 (2022) Citar este artigo

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4 citações

Detalhes das métricas

Neste trabalho, demonstramos o desenvolvimento de um biossensor eletroquímico rápido e sem rótulo para detectar Listeria monocytogenes usando um novo material nanobrush de tiomero estímulo-resposta. Nanopincéis foram desenvolvidos através de codeposição simultânea em uma etapa de nanoplatina (Pt) e tiomeros de alginato (ALG-tiomer). A plataforma ALG-tiomer / nanobrush Pt aumentou significativamente a área superficial eletroativa média dos eletrodos em 7 vezes e manteve as propriedades de atuação (inchaço osmótico estimulado pelo pH) do alginato. O comportamento dielétrico durante a atuação da escova foi caracterizado com sondas redox carregadas positivamente, neutras e negativamente acima e abaixo do ponto isoelétrico do alginato, indicando que a carga superficial do tiomero ALG desempenha um papel importante na aquisição de sinal. A plataforma ALG-tiomero foi biofuncionalizada com um aptâmero seletivo para a proteína internalina A em Listeria para aplicações de biossensor. O carregamento do aptâmero foi otimizado e várias estratégias de captura celular foram investigadas (escova estendida versus recolhida). A captura máxima de células ocorre quando o tiomero/aptâmero ALG está na conformação estendida (pH > 3,5), seguida pela medição de impedância na conformação colapsada (pH < 3,5). Baixas concentrações de bactérias (5 UFC mL-1) foram detectadas a partir de uma matriz alimentar complexa (caldo de galinha) e testes de seletividade contra outras bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus) indicam que a afinidade do aptâmero é mantida, mesmo nesses valores de pH. O novo material híbrido macio está entre os mais eficientes e rápidos (17 min) para biosensor de L. monocytogenes até o momento e não requer pré-tratamento de amostra, constituindo uma nova plataforma de material promissora para detecção de pequenas moléculas ou células.

Listeria monocytogenes é uma bactéria virulenta de origem alimentar, onipresente no meio ambiente (solo e água) que causa centenas de mortes anualmente nos EUA1,2. Todos os anos, são notificados cerca de 48 milhões de casos de doenças de origem alimentar, quase 19% dos quais são devidos à infecção por Listeria monocytogenes, tendo potencialmente um impacto económico negativo de 15 mil milhões de dólares devido a custos com cuidados de saúde, perda de produtividade e perda de vidas3,4. Com sintomas como dores musculares, náuseas, diarreia, vômitos e calafrios1, L. monocytogenes está entre os patógenos de origem alimentar mais letais, com uma taxa de mortalidade de até 30% em indivíduos de alto risco5,6. É particularmente perigoso para as mulheres grávidas, embora geralmente recuperem, os seus bebés podem não sobreviver2.

Listeria monocytogenes é um patógeno difícil de monitorar em ambientes de processamento de alimentos devido à sua capacidade de proliferar sob baixo teor de umidade, condições de alta salinidade ou em temperaturas associadas a unidades comuns de refrigeradores/congeladores7. Uma regra de tolerância zero para L. monocytogenes em alimentos prontos para consumo foi implementada pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA (FDA), pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e pela União Europeia (UE)1, combinada com o O aumento do número de recolhas de alimentos relacionadas com a contaminação por Listeria nos últimos anos8 reforça ainda mais a necessidade de métodos de detecção de agentes patogénicos em tempo real que possam identificar produtos alimentares contaminados antes de chegarem ao público.

O estado da arte atual para detecção de Listeria em plantas de processamento de alimentos, incluindo contagens totais viáveis ​​(TVC), ELISA (ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas) e PCR (reação em cadeia da polimerase), são suscetíveis a erros e leituras falsas, e requerem ambientes laboratoriais dispendiosos com pessoal altamente treinado para serem concluídos9,10. Os resultados dos testes desses métodos são severamente atrasados, exigindo duas etapas consecutivas de enriquecimento (até 48 h) para concentrar/amplificar bactérias antes de uma etapa de detecção qualitativa, porque esses métodos carecem de sensibilidade [~ 100 CFU mL-1 limites de detecção (LOD) ]12,13 e não consegue detectar diretamente baixos níveis de patógenos em amostras complexas, como meios, caldos ou tecidos homogeneizados.

 0.97), the sensitivity to the target bacterium was obtained using the slope of the linear portion and then the 3σ method was used to calculate the limit of detection (LOD)39. Change in impedance (\(\mathrm{\Delta Z}= {Z}_{bacteria}-{Z}_{no \, bacteria}\)) was used to illustrate the electrodes performance independent of media. Selectivity to L. monocytogenes was evaluated by determining sensitivity and LOD in the presence of the identical concentration of another Gram-positive bacteria (S. aureus) in PBS and in sterile vegetable broth./p> 3.5 is noted as (EX), the collapsed brush conformation at pH < 3.5 is noted as (COL), the cell capture state is noted by (cap) and the electrochemical measurement step is noted by (meas). Cell capturing in the extended conformation (pH 7) and sensing at collapsed state (pH 3) provided the highest impedance values (p < 0.05) for all cutoff frequencies and, therefore, sensing efficiency (see also Bode plots in Fig. S3 in the supporting information). The optimum capture of targeted bacteria at the extended form can be related to a higher contact area with the tested solution and an increased probability of aptamer-cell interaction, compared to pH 3 at which the brushes are contracted, and the receptor binding site(s) may be inaccessible. Similar to our previous work on this capture strategy, it is likely that the cells become entangled in the polymer matrix during the sensing step, where aptamer-target binding may no longer be the mechanism for cell capture but rather entanglement during nanobrush collapse. The specificity for this detection platform is rooted in the initial affinity between aptamer and target at pH 7 (extended ALG-thiomer nanobrush), where the collapse at pH 3 likely causes secondary structure changes in the aptamer but also entraps cells in the polymer matrix./p> 0.05) on the LOD (4.5 ± 0.8 CFU mL−1 with L. monocytogenes alone and 5.7 ± 2.1 CFU mL−1 with both bacteria) indicating no cross-reaction between the sensor and S. aureus. The sensitivity increased (p < 0.05) from 39.21 ± 2.61 Ω/log(CFU mL−1) with L. monocytogenes alone to 69.34 ± 2.79 Ω/log (CFU mL−1) when S. aureus was also present. The linear range also changed from 101 to 106 CFU mL−1 with only L. monocytogenes in PBS to 101–105 CFU mL−1 in the bacteria mixture. Ohk et al.29 presented a LOD of 103 CFU mL−1 using the same aptamer in a fiber-optic biosensor to detect Listeria spp. Recently, Oliveira et al.31 using the same aptamer presented similar LODs compared to the current study for L. monocytogenes alone in PBS and in the presence of S. aureus, 2.5 and 2.6 CFU mL−1, respectively; using actuation of chitosan/platinum brushes. While antibody sensors are reported to be prone to give false-positive reactions with S. aureus, which is also a protein A carrier, the aptamer used in the present work was proven to be selective to L. monocytogenes29. This aptamer targets the surface protein Internalin A which is one of the major invasion proteins involved in pathogenesis29. Despite the fact that this protein is structurally analogous to certain cell-wall proteins with internal repeats identified in members of the genera Staphylococcus and Streptococcus65, the present results corroborate that this aptamer can be selective to L. monocytogenes./p> 0.05) to the results in PBS. These results also indicate that the aptamer is able to selectively bind to L. monocytogenes even in complex food matrices. Using the same aptamer, Hills et al.30 reported a slightly higher LOD of 9.1 CFU mL−1 in vegetable broth with a layer by layer reduced graphene oxide/nanoplatinum/chitosan brush electrode that actuated based on chitosan’s pH-response./p>